EcoRV

Struktura EcoRV w kompleksie z dwuniciowym DNA

EcoRV (wym. "eko er pięć", ewentualnie "eko er fał") - enzym, endonukleaza restrykcyjna typu II, wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu E.coli^[1], jest częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych.

W biologii molekularnej EcoRV jest używane jako enzym restrykcyjny. Przy cięciu DNA tworzy tępe końce (patrz: lepkie końce). Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromiczna sekwencja 5'-GAT^▼ATC-3' (nić komplementarna 3'-CTA_▲TAG-5')^[2].

[edytuj] Struktura

Struktura przestrzenna enzymu została rozwiązana metodami rentgenograficznymi w 1997 roku^[3].

[edytuj] Struktura trzecio- i czwartorzędowa

Rdzeń enzymu składa się z pięcioniciowych β-harmonijek flankowanych przez helisy-α. Motyw ten jest konserwatywnie zachowany we wszystkich innych restrykcyjnych endonukleazach typu II. W strukturze można także wyróżnić N-końcową subdomenę dimeryczną, utworzoną przez krótka helisę-α, dwuniciowe antyrównoległe β-harmonijki i długą α-helisę. Ta subdomena jest obecna wyłącznie w enzymach EcoRV i PvuII^[4].

[edytuj] Działanie

Podobnie do EcoRI, EcoRV tworzy homodimer zanim zwiąże się z DNA i rozpozna swoje miejsce cięcia^[5]. Początkowo enzym słabo wiąże się do nici DNA, po czym zaczyna poruszać się w sposób losowy po nici, szukając rozpoznawanego miejsca restrykcyjnego^[4]. EcoRV cechuje duża specyficzność w rozpoznawaniu sekwencji docelowej, szczególnio in vivo^[2]. Po związaniu DNA w miejscu restrykcyjnym, enzym wymusza zmiany konformacyjne DNA, wyginając jego nić o jakieś 50°. W rezultacie rozluźnia to oddziaływania pomiędzy parami zasad, poszerza małą bruzde, a zacieśnia dużą bruzdę w cząsteczce DNA. To zbliża, podlegające cięciu, wiązania fosfodiestrowe do miejsca aktywnego enzymu. Samo cięcie nie wymaga hydrolizy ATP. EcoRV jest jedyną znaną restryktazą II typu wywołującą tak duże zmiany konformacyjne w DNA^[4].

[edytuj] Zastosowania

Z powodu swojej selektywności i specyficznego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (aczkolwiek z powodu tępych końców, mniej efektywnej) (zobacz też: ligaza), enzym ten jest używany w biologii molekularnej, szczególnie w technice klonowania. Enzym do poprawnej pracy wymaga dodania do buforu BSA ^[6].

Przypisy